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滇重樓 Paris polyphylla Sm. var. yunnanensis (Fr.) H. M. 為百合科重樓屬 Paris L. 植物，主要分布于貴 州、云南和四川等地區，是《中國藥典》2015 年版收 載的重樓藥材的基原植物之一，其干燥根莖入藥，具 有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效，是“云 南白藥”“宮血寧膠囊”等多種中成藥的主要原料， 市場需求量較大。市場上的重樓藥材多年以來主要依 賴于野生采挖，導致野生滇重樓藥材幾近枯竭，尋 求合適的栽培馴化滇重樓的方式迫在眉睫。
1 材料與試劑
2012 年 10 月，滇重樓 2 年生育苗的鮮種采自 云南省大理州農業科學院種植基地；2013 年 10 月， 滇重樓 1 年生實生苗和育苗栽培種源的鮮種采自貴 州省種植基地，滇重樓育苗野生種源的鮮種采自貴 州省野生環境，常溫下河沙貯存 4 個月，并經三峽 庫區道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗 室（重慶三峽學院）周濃教授鑒定為百合科植物滇 重樓 Paris polyphylla Sm. var. yunnanensis (Fr.) H. M. 的成熟種子，種子采用單株保存、保證種質資 源的穩定性和均一性。
1.1 AM 真菌
通過美國國際叢枝菌根真菌種質資源保藏中心 購得相應的 AM 真菌純凈菌劑，其菌劑由三峽庫區道 地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室（重慶三 峽學院）進行擴增繁殖、儲存保管。接種菌劑為帶有 孢子、菌絲及侵染后根段的栽培基質，見表 1。
1.2 試藥
對照品重樓皂苷 I（批號 111590-201103）、重 樓皂苷 II（批號 111591-201103）、重樓皂苷 VI（批 號 111592-201103 ）、 重 樓 皂 苷 VII （批號 111593-200402）購自中國食品藥品檢定研究院，質 量分數均大于 98%。乙腈（德國默克公司，色譜純）， 水（娃哈哈純凈水）。
1.3 儀器
DZF-6050MBE 型電熱恒溫真空干燥箱（上海博訊實業有限公司）；CP225D 型分析天平（德國 Sartorius 公司）；TDZ5-WS 型多管架自動平衡離心 機（湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司）； SB-5200DTN 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技 股份有限公司）；LC-20A 型高效液相色譜儀、 UV2450 型紫外可見分光光度計（日本島津集團）。
2 方法
2.1 實驗設計
種子前處理，去除外果皮，用蒸餾水洗凈，10% NaClO 溶液浸泡 15 min 后用蒸餾水洗凈，備用； 紫云英種子用 10% NaClO 溶液浸泡 15 min 后用蒸 餾水洗凈，備用。育苗栽培基質為菜園土與河沙的 混合物（體積比 3∶1，過 2 mm 篩，121 ℃高壓 滅菌鍋內滅菌 2 h）。2013 年 1 月、2014 年 1 月分 別將滇重樓 2 年生、1 年生實生苗育苗，采用室內 常溫栽培法，設置 9 個處理組（AM 真菌組，S1～ S9）和 1 個對照組（CK 組，S10）共 10 組，每組 重復 10 次，每盆接種 180 個孢子的混合菌劑（均 分），與紫云英混合播種培養，待滇重樓種子出土 后除去紫云英植株，每盆間苗 20 株。滇重樓栽培 種源及野生種源新鮮種子于 2014 年 01 月與 AM 真菌混合共生育苗，采用室內常溫栽培方法，設置 9 個處理組（AM 真菌組，S1～S9）和 1 個對照組 （CK 組，S10）共 10 組，每組重復 10 次，每盆接 種 180 個孢子的混合菌劑（均分），與紫云英混合 播種培養，待滇重樓種子出土后除去紫云英植株， 每盆間苗 20 株。滇重樓幼苗生長期間定期澆 Hoagland 營養液。 于 2015 年 6 月，采集栽培種源滇重樓育苗（T1） 和 1 年生滇重樓實生苗（T5）待測滇重樓樣品，于 2015 年 7 月，采集 1 年生滇重樓實生苗（T6）待測 滇重樓樣品，于 2015 年 8 月，采集栽培種源滇重樓 育苗家種（T2）、野生種源滇重樓育苗野生（T4）、1 年生滇重樓實生苗（T7）和 2 年生滇重樓實生苗（T8）待測滇重樓樣品，于 2016 年 8 月，采集種子栽培種 源滇重樓育苗（T3）待測滇重樓樣品。收獲滇重樓的 根莖、根系，洗凈后置于 35 ℃烘箱烘干，用于品質 分析；在冰水浴中洗凈根系，剪成 1.0～1.5 cm 長的 根段，一部分置于福爾馬林-醋酸-70％乙醇（FAA） 固定液中固定后用于菌根侵染率的測定。
2.2 AM 真菌的侵染率
隨機選取浸泡于 FAA 固定液中滇重樓根系 30 條，采用 Philips 等的方法染色、制片、鏡檢，根 據 Trouvelot 等的方法統計菌根侵染率。
2.3 滇重樓幼苗葉片光合色素含量及生理指標的測定
根據張志良等的方法對滇重樓幼苗光合色 素含量測定；過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外分 光光度法測定；過氧化物酶（POD）活性采用愈創 木酚顯色法測定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采 用氮藍四唑法測定；丙二醛（MDA）和可溶性糖含 量采用硫代巴比妥酸法測定；可溶性蛋白含量采用 考馬斯亮藍比色法測定。
2.4 滇重樓幼苗生物量的測定
采收滇重樓后，測定各處理組新鮮根莖質量 后，分別置于 35 ℃烘箱中干燥至恒定質量，測定 不同處理組干質量，計算其折干率。
2.5 不同接種時期滇重樓幼苗根莖中重樓皂苷含量測定
采用《中國藥典》2015 年版重樓藥材項下測定 4 種重樓皂苷的含量。
2.6 數據分析
采用Microsoft Excel 2003軟件作圖，運用SPSS 20.0 進行統計分析。
3 結果與分析
不同接種時期滇重樓幼苗根系均 在一定程度上受到了 AM 真菌的侵染，除 CK 組未 被侵染外，其他處理組的侵染率在 91.29%～ 100.00%，各實驗組均無顯著性差異（P＞0.05）， 這與周濃等的研究結果一致。而在自然條件下， AM 真菌的侵染率為 36.41%～83.7%。綜上可知， 接種外源AM 真菌對滇重樓根系菌根侵染率具有一 定的促進作用，說明通過外源接種 AM 真菌以提高 滇重樓的品質具有可行性。與 CK 組相比，不同接種時期滇重樓 3 種保護酶 CAT、POD 和 SOD 的活性有不同 程度的提高。其中，T1、T5 時期的 POD 與 SOD 活 性提高更為顯著。在不同的處理組中，S6、S8、S9 的 3 種酶活性提高更為明顯。3 種保護酶的活性表 現為 POD＞SOD＞CAT，可能是因為 POD 活性對 環境變化表現的更為敏感。表明接種 AM 真菌有利 于滇重樓葉片保護酶活性提高。
4 討論
研究結果表明，各處理組均能與 AM 真菌形成 一定的共生關系，但各處理組對滇重樓生長發育情 況的影響程度存在差異。與 CK 組相比，菌根化滇重樓的侵染率良好，即 AM 真菌與滇重樓幼苗 根莖形成了菌根，說明通過引入外源叢枝菌根真菌 可提高滇重樓幼苗的生活力。接種 AM 真菌有助 于光合色素含量的提高，進而促進滇重樓的生長發 育?，F有研究表明，AM 真菌能激活植物對多種生 物或非生物脅迫的防御機制，從而提高植物的抗逆 性，包括對病蟲害、重金屬污染、鹽害、干旱等脅 迫的抗性。CAT、POD 和 SOD 作為植物體內清 除自由基的關鍵保護酶，能起到清除活性氧、維持 氧代謝平衡的重要作用。與 CK 組相比，不同接 種時期滇重樓的 3 種保護酶活性均大于對照組，說 明接種 AM 真菌增強了植株對不利環境的抗性。 植株體內的滲透調節物質包括可溶性糖、可溶性蛋 白，其能幫助維系植物細胞內的膨壓進而利于增強 植株的抗逆性。與對照組相比，滇重樓葉片的可溶 性糖的含量均有明顯的增加，但可溶性蛋白變化不 明顯。細胞膜系統的損傷是植物水分脅迫的重要原 因，葉片中 MDA 含量的增多與膜相對透性呈顯著 正相關。各接種時期的 MDA 含量均低于對照 組，表明接種 AM 真菌的各處理組降低了受逆境 環境的脅迫程度。
