魚源熒光假單胞菌生物研究?。?！

養殖魚類低溫貯藏品質下降的主要原因是嗜 冷腐敗微生物的生長繁殖。 在有氧冷藏條件下，假 單胞菌多為淡水魚的特定腐敗菌。 胥亞夫等發現 水產品中主要腐敗菌為假單胞菌屬細菌， 包括熒 光 假 單 胞 菌、 腐臭假單胞菌和邊緣假單胞菌 。 Parlapani 等報道海鯛中的腐敗微生物為假單胞 菌屬，特別是熒光假單胞菌。 楊憲時等研究羅非 魚冷藏過程菌相的變化，發現在 0～10 ℃冷藏過程 中假單胞菌為優勢腐敗菌， 熒光假單胞菌為最優 勢種群。 郭全友等對養殖大黃魚的菌相研究中， 鑒定出腐敗希瓦氏菌和假單胞菌是低溫貯藏大黃 魚的優勢腐敗菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PF01、PF06 和 PF07 為冷藏大黃魚中的優勢 腐敗菌，PF10 為大菱鲆的特定腐敗菌，NCBI 登錄 號 分 別 為 KU173826 、 KU173831 、 KU173832 、 KR706375，PFuk4 為標準菌株， 購買于微生物菌種保藏中心。 LB 肉湯、胰酶大豆肉湯（TSB）、營養瓊 脂（NA），泳動性培養基（胰蛋白胨 1%，NaCl 0.5%， 瓊脂 0.3%）， 均購買于青島海博生物有限公司； SYTO9，Thermofisher，Waltham，MA，USA；96 孔 細 胞培養板，無錫 NEST 生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD 超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰 空氣技術有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；酶標儀 VICTOR X， 美 國 Perkin Elmer 公 司；移 液 器，德 國 Eppendorf 公司； 熒光顯微鏡 LEICA DM4000， 德國萊卡公 司。

1.3 方法

1.3.1 活化培養

將-80 ℃貯藏的 5 株熒光假單 胞菌甘油菌接種于 LB 培養基中 28 ℃，200 r/min 過夜活化后，于 LB 培養基中二次活化。 離心收集 菌體， 用無菌生理鹽水將菌濃度調整到 108 CFU/ mL 待用。

1.3.2 生長曲線測定

將 5 株熒光假單胞菌分離 株過夜活化菌液稀 釋 10 倍 后 按 1%接 種 于 含 有 200 μL TSB 培養基的 96 孔板中，置于 28 ℃下培 養，每隔 3 h 用酶標儀測定 600 nm 處吸光度。

1.3.3 結晶紫法定量檢測生物被膜

將過夜活化 的 細 菌 菌 液 稀 釋 10 倍 后 按 1%接 種 量 接 種 于 TSB 培養基， 并以 200 μL 分裝到 96 孔板中，28 ℃靜置培養 3，6，9，12，18，24 h 后， 采用結晶紫法 測定生物被膜形成量。 根據 Djordjevic方法略做 修改，去除孔板中菌液，每孔用 250 μL PBS 緩沖 液輕輕漂洗 3 次，干燥后，加入 200 μL 0.2%的結 晶 紫 溶 液，染 色 15 min 后 清 洗，干 燥，最 后 加 入 200 μL 33%冰乙酸， 用酶標儀測量其 590 nm 處 吸光值。

1.3.4 胞 外 多 糖 （EPS） 含 量 測 定

參 考 Harimawan 等的方法略作修改提取胞外多糖。 具體 為培養 12，18，24 h 后的 10 mL 菌液，4 ℃離心（5 000×G，20 min）， 去 上 清 ， 然 后 用 磷 酸 緩 沖 液 （Phosphate Buffered Saline，PBS）重懸菌體，在 80 ℃水浴 30 min，4 ℃離心 （15 000×G，30 min），用 0.22 μm 濾膜過濾，得到上清液用苯酚硫酸法測定 胞外多糖含量。

1.3.5 珠渦流法

在 1.3.1 節所述的細菌菌懸液中加入不銹鋼片 （10 mm ×10 mm） 和蓋玻片（22 mm × 22 mm）。在 28 ℃靜置培養 1 h。參考 Nguyen 等珠渦流法對粘附在不銹鋼片表面的細菌進行 計數。具體方法如下，用 PBS 緩沖液輕輕洗去不銹 鋼片表面的浮游菌， 然后放于裝有 10 mL 無菌生 理鹽水的離心管中，加入適量玻璃珠，劇烈渦旋 3 min 后，梯度稀釋計數。

1.3.6 熒光顯微鏡觀察

熒光顯微鏡觀察參照 Bagge 等的方法。 具體如下：用滅菌 PBS 洗去蓋 玻片上浮游菌， 放入 2.5%的戊二醛中固定 1.5 h， 用 PBS 洗去戊二醛，烘箱干燥后，滴加 70 μL 0.1 μL/mL SYTO9 于蓋玻片上， 均勻覆蓋于表面，避 光孵育 20 min，吸去多余的染料后，放置熒光顯微 鏡下（40×）觀察。

1.3.7 泳動性測定

參考 Sperandio 等的方法， 泳動瓊脂培養基凝固后，將 5 μL 過夜培養的菌液 滴在平板中心，吸干后，移至 28 ℃培養箱中靜置 培養 24 h。

1.3.8 蛋白酶活性測定

參照 SB/T 10317-1999 標準中福林酚法測定蛋白酶活力方法，在 40 ℃ 下每分鐘水解酪蛋白產生 1 μg 定義為 1 個蛋白 酶活力單位。

1.3.9 嗜鐵素檢測

參考文獻，制作 CASAD 嗜鐵素檢測平板，利用 CASAD 嗜鐵素平板法可檢 測總的嗜鐵素， 將過夜培養的菌液離心取上清 5 μL 加入平板中，置于 28 ℃培養 24 h 后觀察。

1.3.10 生 物 報 告 菌 檢 測

信 號 分 子 參 考 Ravn 等方法并略作修改。 報告菌紫桿菌 CV026 活化 后，取 5 mL 加入到 50 mL LB 瓊脂中，混合均勻后 倒平板，待冷卻后，平板中心打 孔，加 入 菌 液，28 ℃培養，觀察顏色變化。

1.3.11 統計學處理

每組樣品設 3 個重復，結果 取其平均值。采用 Microsoft Excel 和 Origin 8.5 進 行數據處理和 作圖， 并利用 SPSS21.0 的 ANOVA 進 行 方 差 分 析 P<0.05 表示有統計學意 義。

2 結果與分析

研究測定了 5 株熒光假單胞菌分離株在 28 ℃下靜置培養的生長曲線。 如圖 1 所示，熒光假單胞菌在 3 h 到 12 h 期間生長迅速，尤其是 PF07 在 對數生長期生長最快，PF01、PF06 和 PF10 次之， 且這 3 株菌的生長基本保持一致，PFuk4 生長最慢。 在 18 h 后 PF07 和 PFuk4 生長緩慢，在培養 24 h 進 入穩定期，而其余 3 株菌依然在逐漸增長，在 27 h 進入穩定期。 PF01、PF06、PF07、PF10 和PFuk4 5 株菌在穩定期的細菌量分別達到 1.7，1.7，1.5，1.7 和 1.4（OD600），其中 PF01、PF06 和 PF10 的細菌量 最高，PFuk4 的菌量最少。

熒光假單胞菌在 96 孔塑料孔板上也能形成 被膜， 其中培養 3 h 時 5 株菌的生物被膜量基本 保持一致（P>0.05）。 隨著細菌生長，熒光假單胞菌 的生物被膜量也開始顯著增加 ， 培 養 至 12 h， PF01、PF06、PF07 和 PF10 的 生 物 被 膜 量 達 到 最 高，分別為 1.71，1.72，2.24 和 1.61（OD600），而 PFuk4 在 18 h 達到最高，為 2.50，隨即又開始下降。 在熒 光假單胞菌分離株中 PF07 和 PFuk4 的生物被膜形 成能力較強，且 PF07 被膜形成周期較短。 研究表 明，熒光假單胞菌具有較強的生物被膜能力，而且 不同來源的熒光假單胞菌生物被膜形成能力差別 較大。 Sim觛es 等報道熒光假單胞菌模式菌株形 成生物被膜的能力高于從乳制品加工環境中分離 得到的分離株。 課題組也發現不同來源的銅綠 假單胞菌形成生物被膜的能力也有所不同。 在食 品接觸表面的腐敗致病菌的粘附及生物被膜形 成，增加產品加工過程的交叉污染，縮短貨架期， 給食品產業帶來嚴峻挑戰。

3 結論

研究表明，5 株熒光假單胞菌都能在試管和 塑料孔板中形成大量生物被膜， 且能較快地粘附 于不銹鋼片與玻璃片表面。 熒光假單胞菌具有較 強的泳動性、蛋白酶活性及產嗜鐵素，其中 PF07 較強的生物被膜形成能力和致腐表型， 可能與高 活性的 AHLs 存在內在關聯。