用博迅干燥箱對HepG2細胞胰島素抵抗模型中脂代謝

1 材料與方法 

1. 1 材料

1. 1. 1 細胞株

HepG2 細胞人肝癌細胞株，購于中 國科學院細胞庫。

1. 1. 2 藥物及試劑

苦酸通調方( 長春中醫藥大 學附屬醫院藥房提供) ; 二甲雙胍( HY-17471A，MCE 公司) ; DMEM 低糖培養基、胎 牛 血 清( 12100061、 16140071，Gibco 公司) ; 細胞裂解液、噻唑藍( MTT) 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒( P0013、C0201，武 漢碧云天生物公司) ; 棕櫚酸( MB7088，大連美侖生 物技術有限公司) ; 油紅 O 染色試劑盒、三酰甘油 ( TG) 檢測試劑盒、膽固醇檢測試劑盒( D027、A110、 A111，南京建成生物工程研究所) ; 兔抗人單克隆抗 體 AMPKα，單克隆抗體 p-AMPK( Thr172) ，單克隆 抗體乙酰輔酶 A 羥化酶( ACC) ，多克隆抗體 p-ACC ( Ser79) ( 美 國 Cell Signaling 公 司，批 號 分 別 為 5832，50081，9272，9336) ; 兔單克隆抗體 SREBP-1 ( 557036，美國 BD 公司) ; 辣根過氧化物酶標記山羊 抗兔多克隆抗體免疫球蛋白( Ig) G、辣根過氧化物 酶標 記 山 羊 抗 小 鼠 單克隆抗體 IgG ( BA1054、 BA1050，武漢博士德生物工程有限公司) ; 二喹啉甲 酸( BCA) 蛋白濃度測定試劑盒( A0216，碧云天生物 技術研究所) 。

1. 1. 3 儀器

濕化型 CO2 恒溫培養箱( 3111，Thermo) ; YZ-875 超凈工作臺( 江蘇蘇州凈化設備廠) ; 低溫高速離心機( 5804R，德國 Eppendorf) ; DK-S2 微 型振蕩器( 浙江金華實驗儀器廠) ; 鼓風干燥箱( 上海博迅醫療生物儀器公司) ; M200 PRO 酶標儀( 瑞 士 Tecan 公司) ; 電泳儀( 美國 Bio-Rad 公司) ; 濕轉 系統( 美國 Bio-Rad 公司) ; 超低溫冰箱( 900，美國 Thermo Fisher) ; ECL 發 光 儀 ( 美 國 Protein Simple 公司) 。

1. 2 細胞培養

HepG2 細胞培養在 37℃，5%CO2 濕化 條 件 中，給 予 10% 胎 牛 血 清 ( FBS) 、青 霉 素 100 U/ml和鏈霉素 100 μg /ml 的低糖 DMEM 培養 基培養，待細胞融合度約 80%時進行傳代。各干預 組加入無血清低糖 DMEM 培養基培養細胞 24 h，使 各組細胞生長同步化后再進行下一步實驗。

1. 3 MTT 比色法檢測細胞活力

將 MTT 溶于磷酸 鹽緩沖液( PBS) 為 5 mg /ml 過濾除菌后備用，選擇 細胞融合度約 80%的 HepG2 細胞，胰酶消化后，以 8 000 個細胞/孔的密度接種于 96 孔板。細胞貼壁生 長 24 h，吸棄原培養基，加入不同的干預液100 μl， 培養 24 h，每孔加入 MTT 溶液 10 μl，置細胞于培養 箱內避光孵育 4 h。震蕩混勻，490 nm 處測定吸光 度。以對照組細胞的存活率為 100%計算不同組別 細胞存活率。

1. 4 高糖聯合棕櫚酸孵育建立

HepG2 IR 模型 稱 取 9. 165 mg 棕櫚酸標準品溶于 0. 25 ml 無水乙醇 中，將溶解后的棕櫚酸加入 11. 88 ml 高糖 DMEM 培 養〔其中含有 0. 12 ml FBS，0. 25 g 牛血清白蛋白 ( BSA) 〕，55℃ 水浴 15 min，冷卻后過濾除菌即為 3 mmol /L棕櫚酸溶液，造模時稀釋至 0. 25 mmol /L， 孵育細胞 24 h，建立 HepG2 IR 模型。

2 結 果

2. 1 對 HepG2 細胞葡萄糖攝取量的影響

與正常 組〔( 1. 00±0. 02) mmol /L〕比較，模型組細胞的葡萄 糖攝 取 量 明 顯 下 降 〔( 0. 63 ± 0. 02 ) mmol /L，P ＜ 0. 05〕; 與模型組相比，苦酸通調方高劑量組、陽性 對照 組 顯 著 增 多 HepG2 IR 細胞葡萄糖攝取量 〔( 0. 84± 0. 05) mmol /L，( 0. 93 ± 0. 02) mmol /L，P ＜ 0. 05〕，且增加細胞葡萄糖攝取量的效果呈劑量依 賴性?？嗨嵬ㄕ{方低、中劑量組攝取量為〔( 0. 66± 0. 03) mmol /L，( 0. 72±0. 03) mmol /L〕與模型組無差 異( P＞0. 05) 。

2. 2 油紅

O 染色 造模液作用后細胞內脂滴明顯 增多，隨著苦酸通調方濃度的增加，細胞脂滴逐漸減 少。見圖 1。

3 討 論

中醫認為 T2DM 屬“消渴”“脾癉”范疇，苦酸通 調方依據六郁和絡滯病機，確立“苦酸制甜”、“辛開 苦降”、“活血通絡”、“解毒通絡”為基本治法，選用 丹參、黃連、黃芪、知母、天花粉、制紅曲、肉桂、烏梅、 生地、酒大黃組成本方。諸藥辛苦酸并用，寒溫相 佐，達到了苦酸制甜，辛開苦降，通達絡脈之功。

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