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再生障礙性貧血（AA）的發病機理十分復雜， 目前認為其發病主要與造血干細胞（HSC）量與 質的改變、骨髓造血微環境缺陷和免疫功能紊亂 有關。骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cell, MSC）是一種位于骨髓中具有自我更新、分化增殖 和多向分化潛能的干細胞。MSC 是骨髓造血微環境的重要組成部分，在造血調控中具有重要作用。
材料和方法
病例資料 本院 2016 年 7 月 - 2017 年 2 月確診再生障礙性 貧血患者 10 例；其中 4 例男性和 6 例女性，年齡 25±10 歲；同時招募 5 名健康供者，其中 4 名男 性和 1 名女性，年齡 31±15 歲作為對照，本研究 得到本院倫理委員會的批準，所有受試者均簽署 知情同意書。 試劑與儀器 骨髓間充質干細胞來源于本醫院知情同意的再 生障礙性貧血患者及健康供者；High DMEM 基 礎培養液購自中國 Hyclone 公司；FBS 購自美國 Gibco 公司；DAPT 購自日本 Sigma 公司；CCK8 試劑盒為中國碧云天公司產品；AnnexinV-FITC/ PI 試劑盒為中國南京凱基生物公司產品；細胞 周期檢測試劑盒為中國北京嘉美生物公司產品； PMSF 為美國 Amresco 公司產品；VEGF antibody 為美國 Affinity 公司產品；β-actin antibody 為英 國 Abcam 公司產品；油紅 O 為中國生工生物公 司產品；TRIZOL、RNA 溶解液均為中國全式金 公司產品；氯仿、異丙醇均為中國國藥集團化學 試劑有限公司產品；DEPC 為美國 Amresco 公司 產品；FITC 購自中國 Keygen 公司產品。低速離 心機購自中國上海貝恩生物科技有限公司；CO2 培養箱購自中國上海博訊公司；倒置顯微鏡為 日本 Olympus 公司產品；酶標儀為美國 Thermo Scientific 公司產品；流式細胞儀為美國 Becton Dickinson 公司產品；超凝膠成像儀為美國 BioRad 公司產品。 骨髓間充質干細胞（MSC）的分離及鑒定 從 AA 患者收集骨髓（BM）標本（5 ml），并從 健康供者收集正常 BM 標本。從 AA 患者的 BM 分 離 MSC。將 5 ml 骨髓與 DMEM（1︰1） 混 合 的 BM 樣品添加到淋巴細胞分離培養液（1.077 g/ml） 上，并通過離心機分離。將骨髓單核細胞重懸于DMEM 培養液中，并以 1×105 /ml 的密度接種于培 養瓶中。在 37 ℃、5％ CO2、飽和溫度的培養箱中 培養 48 h 后更換培養液。培養 3-4 d 后，細胞生 長至 80%-90% 融合，消化，傳代，依次記為第 2、 第 3…代細胞。取第 3 代細胞進行流式細胞術檢測。 待融合達 80%-90% 時，用 2.5 g/L 胰蛋白酶消化 2-4 min，待 90% 左右細胞懸浮后用血清終止消化， 應用吸管仔細吹打使之形成細胞懸液。細胞懸液 經 100 目的濾篩過濾。離心后棄上清，用 PBS 制 成 2×105/ml 的細胞懸液，將細胞懸液分裝至 4 支 樣品管中。在 4 支樣品管中分別加入：FITC antihuman CD34、FITC anti-human CD44、FITC antihuman CD45、FITC anti-human CD90；混勻，4 ℃ 下避光反應過夜。棄上清，每管再加入 PBS 0.5ml 重新混懸細胞，用流式細胞儀檢測細胞表面抗原 CD34、CD90、CD44、CD45 的表達。 實驗分組 實驗分為 5 組：①正常 MSC 組：正常人的 MSC 于 DMEM 完全培養液中培養；② AA 組：AA 患者的 MSC 于 DMEM 完全培養液中培養；③ DAPT 組： AA 患者的 MSC 于含有 10 μmol/ LDAPT 的 DMEM 完全培養液中培養；④ VEGF 組：AA 患者的 MSC 于含有 100 ng/ml VEGF 的 DMEM 完全培養液中培 養；⑤ DAPT+VEGF 組：AA 患者的 MSC 于含 10 μmol/LDAPT 和 100 ng/ml VEGF 的 DMEM 完全培 養液中培養。 CCK8 檢測細胞增殖活性 通過細胞計數試劑盒 8 檢測不同組中 MSC 的增 殖能力。將 MSC 接種在 96 孔板（每孔 100μl） 中并在 37 ℃下用 5％ CO2 培養直至完全粘附。用 DAPT 或 / 和 VEGF 處理 48 h 后，向每個孔中加入 10μl CCK8 溶液并孵育 2 h。通過酶標儀檢測 450 nm 處的光密度（OD）。 細胞凋亡和細胞周期檢測 采用流式細胞術檢測不同組 MSC 的凋亡和細胞周 期。用 DAPT 或 / 和 VEGF 處理 48 h 后，用 0.25％ 胰蛋白酶消化 MSC。通過以 250 ×g 離心收集細 胞，并用冷磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌 2 次。然 后將這些細胞重懸于 300 μl 結合緩沖液中，并與 5 μl 膜聯蛋白 V- 熒光素異硫氰酸酯（FITC）在 室溫下黑暗中孵育 15 min。隨后在室溫下與 10 μl 碘化丙啶（PI）在黑暗中孵育 10 min，在流式細胞 儀上分析細胞凋亡。在檢測細胞周期中，將消化的 MSC 用 5 ml 70％冷乙醇在 4 ℃下固定過夜。用 冷 PBS 洗滌 2 次后，將這些細胞與 0.5 ml PI 在黑 暗中孵育 20 min，最后在流式細胞儀上分析細胞 在細胞周期中的分布。
結 果
AA患者和健康供者 MSC的分離培養 圖1為 AA 患者骨髓 MSC 分離后 d 1 及分離培養 后 d 7 的圖像。圖 2 為骨髓間充質干細胞免疫表型細胞比例流式圖。由圖可見，正常組和 AA 組 MSC 細胞 CD34 和 CD45 均低表達。CD44 和 CD90 均高 表達，AA 組 CD44 和 CD90 表達略高于正常組，但 無顯著性差異（P ＞ 0.05）。2 者細胞群體基本一致。 細胞增殖活性 CCK8 檢測結果顯示，與正常 MSC 組相比，AA 組 細胞OD值降低，說明細胞增殖降低。與AA組相比， 經過DAPT處理后，細胞OD值降低，細胞增殖降低； 經過 VEGF 處理后，細胞 OD 值增加，細胞增殖增 加；經過 DAPT 和 VEGF 聯合處理后，細胞增殖 高于 DAPT 單獨處理組，但低于 VEGF 處理組（圖 3）。結果提示，AA 患者細胞增殖弱于正常對照者細胞，VEGF 能改善 AA 引起的細胞增殖降低現 象。Notch 信號通路的抑制會加劇 AA 患者 MSC 的 增殖抑制。
討 論
再生障礙性貧血（AA）是一種臨床常見的血液系 統疾病，其臨床表現為全血細胞減少，繼發貧血、 出血、感染而危及患者生命 。造血干細胞（HSC） 移植和抗胸腺細胞球蛋白聯合環孢菌素 A 和雄激 素是 AA 的主要治療策略 [2,3] 。目前研究表明，骨 髓間充質干細胞（MSC）作為骨髓基質細胞的前體 細胞 , 是一類具有自我更新能力和具有免疫調節作 用的干細胞 , 是骨髓造血微環境的重要組成部分 , 其通過介導造血干細胞黏附 , 分泌多種細胞因子和 生長因子而發揮造血支持作用。據報道，MSC 在再生障礙性貧血細胞增殖，分化和造血方面具 有重要作用 , 并發現 CD106 在 MSC 通 過 NF-κB 在 AA 中發揮重要作用。MSC 可以通過調節幾乎 所有免疫細胞的功能來支持造血功能并維持免疫 穩態 。同時，AA 患者 MSC 表現出異常的基因表 達譜和異常的免疫學特性，表明 AA 患者的 MSC 功能異常 。然而，仍需要研究 MSC 對 AA 的分 子機制。
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