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草魚（Ctenopharyngodon idellus）肉質鮮嫩、營養豐 富，深受消費者的喜愛，是我國淡水養殖產量最高的魚 類，2017年產量高達534.56萬 t。水產品在貯藏、運輸 以及銷售過程中，常常由于幾種微生物的活動而導致腐 敗變質，這些微生物被稱為特定腐敗菌，是引起水產品 腐敗的關鍵因素。已有研究顯示氣單胞菌是冷藏草魚 的特定腐敗菌，草魚在4 ℃貯藏8 d時，氣單胞菌數量達 到8.49（lg（CFU/g）），占細菌比例的48.76%。氣單 胞菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陰性菌，最低生長溫度為 0～5 ℃，可以在低溫條件下與其他嗜冷菌競爭，因此在 冷藏水產品中常常檢出，魚類水產品中氣單胞菌的污染 率達31.9%。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）、 Luria-Bertani（LB）肉湯、LB瓊脂、生理生化實驗試劑盒青島海博生物技術有限公司；結晶紫、乙醇 國藥 集團化學試劑有限公司； N - 丁?；呓z氨酸內酯 （N-butanoyl-L-homoserinelactone，C4-HSL）、N-己酰 基高絲氨酸內酯（N-hexanoyl-L-homoserinelactone，C6- HSL） 上海甄準生物科技有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒、2×EasyTaq PCR Supermix 全式金生物 技術有限公司；RP-18 F254S反相C18-薄層色譜板 德國 Merck公司。
1.2 儀器與設備
SHP-250生化培養箱 上海培因實驗儀器有限公司； HY-60振蕩搖床 武漢匯誠生物科技有限公司；LDZX40II型高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械公司；SWCJ-2FD 超凈工作臺 上海博迅實業有限公司；UV-1300 型紫外-可見分光光度計 上海美析儀器有限公司； Tanon-5200凝膠成像系統 上海天能科技有限公司； KH19A高速離心機 湖南凱達科學儀器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 細菌的分離
冷藏草魚貯藏8 d（貨架期終點），隨機取出2 尾， 無菌條件下取腹部魚肉25 g，參照Wang Guangyu等的 方法分離氣單胞菌。挑取菌落數在30～300 CFU的平板， 對單菌落進行純化并保存。純化的菌株以W1、W2、 W3……進行命名。
1.3.2 細菌的鑒定
利用全式金細菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA， 然后擴增細菌的16S rRNA序列，將聚合酶鏈式反應 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往生工生物工程 （上海）股份有限公司測序。測序結果利用NCBI數據庫 進行比對。 將分離的氣單胞菌屬細菌進行氧化酶、氨基酸、糖 類利用、七葉苷等生理生化實驗，在細菌種水平上進一 步鑒定。
1.3.3 AHLs活性檢測
平板劃線法：將待檢測菌株與報告菌株CV026在LB平 板上平行劃線，28 ℃培養18～24 h，觀察顏色變化。 報告平板法：利用報告平板法檢測細菌生長過程中 的AHLs活性變化。過夜活化的菌株W41和W69接種于 LB肉湯，每隔4 h取10 mL菌液，12 000 r/min離心10 min 后，獲得細菌上清液，將細菌上清液經0.22 μm微膜過濾除菌后，于－20 ℃保存備用。取過夜培養至對數期的紫 色桿菌CV026 2～3 mL，加入冷卻至40 ℃的含1.5%瓊脂 的LB中，混勻后傾倒平板。待平板凝固后，用無菌打孔 器在瓊脂中央打孔，加入50 μL不同培養時間的細菌上 清，于28 ℃培養24～48 h，用游標卡尺量取紫色區域直 徑，直徑越大表明AHLs濃度越高。
2 結果與分析
利用分子生物學方法，對20 株細菌進行16S rRNA擴 增，獲得的序列經NCBI數據庫進行BLAST比對，結果 顯示均為氣單胞菌屬（Aeromonas）。生理生化實驗結果 （表1）顯示，本研究分離的氣單胞菌氧化酶反應均為陽 性，均不能利用鳥氨酸和阿拉伯糖，而均具有利用葡萄 糖產酸的能力，但是相同種水平的細菌在精氨酸、賴氨 酸、七葉苷、水楊苷等的利用上存在差異。Abbott等的 研究也顯示氣單胞菌屬在種水平的鑒定比較困難，傳統 的生理生化反應多有重疊，很難明確區分，而且鑒定的 實驗方法也不一致。結合16S rRNA結果，本研究分離的 氣單胞菌屬包括殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida，7?株）、 嗜水氣單胞菌（A. hydrophila，5?株）、中間氣單胞菌 （A. media，3?株）、A. rivuli（3?株）和A. molluscorum （2?株），其中嗜水氣單胞菌包含多個亞種。
利用結晶紫染色法半定量檢測氣單胞菌的生物膜 形成情況，因為葡萄糖促進細菌生物膜的形成，所以在 初步檢測細菌的生物膜形成能力時，采用含有葡萄糖的 TSB肉湯進行培養。參考Stepanovic等的方法，將空 白孔A590 nm值的3?倍標準差作為臨界cut-off值，根據A590 nm 值將細菌分為以下幾類：A590 nm≤0.20，弱生物膜形成能 力；0.20＜A590 nm≤0.80，中等生物膜形成能力；A590 nm＞ 0.80，強生物膜形成能力。
3 結 論
檢測了冷藏草魚源分離獲得的20 株氣單胞菌 Aeromonas spp.的群體感應現象和生物膜形成情況，有 18 株氣單胞菌可以產生AHLs信號分子，20 株菌均顯示 有不同強弱程度的生物膜形成能力。以生物膜形成能力 較強的2 株菌A. salmonia W41和A. salmonia W69為主要對 象，結果表明2 株菌的AHLs活性具有菌體密度依賴性， 該2 株菌主要產生C4-HSL和C6-HSL信號分子，AHLs對 細菌的生物膜形成能力影響不同，其中高濃度C6-HSL 促進A. salmonia W41生物膜的形成；而高濃度AHLs降 低了A. salmonia W69的生物膜形成，低濃度AHLs促進 A. salmonia W69生物膜的形成。本研究顯示大多數草魚 源氣單胞菌可以產生群體感應信號分子，并且AHLs可以 影響氣單胞菌生物膜的形成情況，為水產品保鮮劑的開 發提供一定的理論支持。
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