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土霉素( OTC) 是一種四環素類抗生素，能有效抑制致病微生物感染以及細菌生長繁殖，因其抗菌 性好、成本低，在醫療衛生、農業、畜牧業和水產養殖業中得到了廣泛應用。但長期使用抗生素會造 成其殘留量增多和在環境中的累積，增強細菌、病毒的耐藥性，易引發公共安全等問題。因此， 發展簡單、快速、靈敏、低成本的抗生素檢測方法對環境監測、疾病預防具有重要意義。
1 實驗部分
1. 1 材料與儀器
石墨粉( 青島富潤達石墨有限公司) ; 土霉素( OTC) 、金霉素、四環素( 純度大于 98%，上海泰坦科技股 份有限公司) ; 鈦酸正丁酯( 分析純) 、90%( 脫乙?；? 殼聚糖( Chitosan，CHIT) 、25%戊二醛( GA) 購自國藥 集團化學試劑有限公司; 三羥甲基氨基甲烷( 純度大于 99%) 、牛血清白蛋白( 純度大于 96%，BSA) 購自上 海麥克林生化科技有限公司; 氨基標記的 OTC 適配體序列( 5-NH2-( CH2 ) 6-GGA ATT CGC TAG CAG GTT GAC GTT GAC GCT GGTGCC CGG TTG TGG TGC GAG TGT TGT GTG GAT CCG AGC TCC ACG TG-3) 由生工生 物工程( 上海) 股份有限公司合成。其它試劑均為市售分析純，實驗用水為18. 2 MΩ·cm 的超純水。 CHI600D 電化學工作站( 北京華科普天科技責任有限公司) ; KQ5200V 超聲波清洗儀( 昆山市超聲 儀器有限公司) ; TGL － 20M 臺式高速冷凍離心機( 上海盧湘儀離心機儀器有限公司) ; 博迅GZX-9030MBE 電熱鼓風干燥箱( 上海博迅實業公司醫療設備廠) ; DF － 101S 集熱式恒溫磁力攪拌器( 上海梅香儀器有 限公司) ; SU8010 日立高分辨場發射掃描電鏡( 日本株式會社公司) ; Nexus470 傅里葉變換紅外光譜儀 ( Nicolet 公司) ; HSX － F /UV300 氙燈光源( 北京紐比特科技有限公司) 。
1. 2 標準溶液的配制
1. 2. 1 土霉素溶液
稱取適量 OTC 用 PBS 緩沖液( 0. 1 mol /L KH2PO4 － 0. 1 mol /L Na2HPO4 ) 溶解定 容，配成 0. 01 mol /L OTC 溶液作為母液，于 － 20 ℃ 避光保存。所需不同濃度的 OTC 以此逐級稀釋， 于 4 ℃冰箱保存。
1. 2. 2 土霉素適配體( OTC － aptamer) 溶液
將所購 OTC － aptamer( 100 mmol /L NaCl，20 mmol /L Tris － HCl，5 mmol /L KCl，1 mmol /L CaCl2，2 mmol /L MgCl2 ) 的鏈序列 1 OD，在 12 000 r/m 下離心， 加入適當體積緩沖液配成 100 μmol /L 的貯存液，于 － 20 ℃冰箱保存。用 Tris － HCl 緩沖液將貯存液稀 釋至 1. 5 μmol /L，于 4 ℃冰箱保存。使用前，在 95 ℃加熱 5 min 后進行淬火，自然冷卻至室溫。
1. 3 傳感界面的構建
1. 3. 1 氧化石墨的制備
采用常規的 Hummers 法制備氧化石墨: 在適量濃 H2 SO4、NaNO3 和石墨 粉存在下，緩慢加入 KMnO4，攪拌反應一段時間后，加入一定量的 30% H2O2 除去未反應的 KMnO4， 離心得到沉淀物，用 5% 稀鹽酸洗滌、離心多次，至濾液中不能檢出 SO2 － 4 ，將沉淀物放入透析袋中， 在水中透析至 pH 值接近中性。將產物放入 60 ℃烘箱中干燥，得到氧化石墨。
1. 3. 2 FTO 導電玻璃的清洗
將 FTO 導電玻璃依次在丙酮、無水乙醇和水中各超聲清洗 15 min 后， 在烘箱中烘干。
1. 3. 3 TiO2 /FTO 導電玻璃電極的制備( TiO2 /FTO)
先用水熱法制備納米 TiO2，即在 100 mL 燒杯 中加入 30 mL 水，再加入 30 mL 濃鹽酸，攪拌條件下緩慢加入 1 mL 鈦酸正丁酯，攪拌 30 min 后得到 混合液。量取適量混合液倒入反應釜中，將烘干的 FTO 導電面朝下插入有混合液的反應釜中，蓋緊， 放入160 ℃干燥箱中，反應6 h。樣品自然冷卻后，用水清洗玻璃，再放入450 ℃馬弗爐中恒溫3 h 后， 即得到 TiO2 /FTO 導電玻璃電極。
1. 3. 4 TiO2 － 石墨烯/FTO 納米復合電極( TiO2 － rGO/FTO) 的制備
將 100 mg 氧化石墨分散于 300 mL 水中，超聲分散 2 h，得到氧化石墨烯( GO) ，并以此作為工作液; 用玻璃刀將 TiO2 /FTO 導電玻璃 切成 1 cm × 1 cm，以其作為工作電極，鉑絲為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，采用循環伏安法( 掃描范圍為 － 2. 5 ～ 2. 5 V，掃描速率為 50 mV·s － 1 ) 進行電化學還原，經適當時間后，取出工作電極， 用水沖洗并吹干，即得到 TiO2 － rGO/FTO 納米復合電極。
1. 3. 5 土霉素適配體的固定化修飾
在 TiO2 － rGO/FTO 納米復合材料電極表面滴涂 90 μL 殼聚糖溶 液，在空氣中干燥過夜成膜，用水清洗吹干后，將 50 μL 稀釋的戊二醛溶液( 2. 5% ) 滴涂至修飾電極表 面，室溫下放置 1 h。清洗并干燥后，滴涂50 μL 1 μmol /L 的 OTC 適配體，在4 ℃冰箱中放置12 h 后， 用 PBS 緩沖液洗去未反應的 OTC 適配體，滴加 50 μL BSA 在 37 ℃反應 1 h，封閉殘留位點，經 PBS 緩 沖液沖洗后，即得到土霉素適配體修飾的 TiO2 /石墨烯復合材料電極( Aptamer/TiO2 － rGO/FTO) 。
1. 4 OTC 的檢測
將制備好的傳感界面( Aptamer/TiO2 － rGO/FTO) 與 50 μL 不同濃度 OTC 溶液( 0. 1 mol /L PBS，pH 7. 4) 在 60 ℃下反應 1 h 后，用水清洗。采用 150 W 氙燈作為激發光源，在 CHI600D 電化學工作站( 三 電極體系，其中修飾電極為工作電極，鉑絲為對電極，飽和甘汞電極為參比電極) 上，選用安培電流時 間曲線法( 初始電位 － 0. 1 V，運行時間 100 s) 記錄 OTC 反應前后的光電流值，以光電流的變化值作為 與目標物濃度對應的信號值。
2 結果與討論
光電化學適體傳感器檢測土霉素的實驗原理如圖 1 所示。實驗采用 FTO 導電玻璃為基底，在其表 面制備了 TiO2 /石墨烯復合材料，通過滴涂殼聚糖溶液，使電極表面帶上氨基，通過戊二醛交聯，使氨 基標記的土霉素適配體牢固地修飾至電極表面。采用電化學工作站檢測修飾了土霉素適配體的光電流， 此時得到的光電流為 I0。將修飾電極用于某一濃度的土霉素溶液測定時，土霉素與其適配體發生特異 性結合形成復合物，測得光電流值為 I。由于目標物與適配體的特異性結合，阻礙了光電傳感界面對光 的有效吸收及光生電子的轉移，從而導致光電流減小，其信號值用 ΔI 表示，ΔI = I0 － I?；陔娏鞯淖?化值與待測物土霉素的濃度成正比，從而實現土霉素的測定。
3 結 論
在 FTO 先后用水熱法及電化學方法制備了納米 TiO2 /石墨烯光電傳感基底，比較了單一材 料及復合體系的光電化學性能。結合土霉素適配體對土霉素檢測的專一性與光電化學法的快速、經濟、 簡單、靈敏的優點，成功構建了一種性能優良、穩定性可靠、成本低、選擇性好的測定土霉素的光電 化學傳感器，實現了對水樣中微量土霉素的檢測。在優化條件下，該傳感器的線性范圍為 5. 0 × 10 － 9 ～ 5. 0 × 10 － 6 nmol /L，檢出限為 1. 0 × 10 － 9 mol /L，有望用于實際樣品中微量土霉素殘留的測定。
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