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1 背景
目前，紙塑鋁復合食品包裝材料是以食品專用紙 板為基料，由聚乙烯、紙、鋁箔等復合而成的紙質包 裝材料。因其包裝的便利性，紙塑鋁復合食品包裝材 料被廣泛應用于液態乳制品、植物蛋白飲料、果汁飲 料、酒類產品以及飲用水等領域，但原材料中的塑料 以及印刷油墨、膠黏劑含有的重金屬殘留物通常會遷移到包裝產品中，對產品造成污染并損害消費者 健康。此外，我國已經研發了多種以動植物為原料 的可食性包裝材料，并廣泛應用于各類食品包裝。但 環境污染致使動植物體內積蓄鉛、砷、鎘和汞等重金 屬，這也給可食性包裝材料的應用帶來了安全隱患。 因此，研究重金屬與生物大分子間的相互作用機理及 重金屬毒理分析，對拓展食品包裝材料的應用領域至關重要。
2 實驗部分
2.1 實驗試劑及儀器設備
1）主要試劑 木瓜蛋白酶 [EC 3.4.22.2]（生物試劑）、對氯汞 苯甲酸（化學純），美國 Sigma 公司；酪蛋白，生 物試劑，上海伯樂奧生物科技有限公司；三氯乙酸、 磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，化學純，上海國藥集團化 學試劑有限公司；去離子水，實驗室自制。
2）主要儀器與設備 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，DF-101S 型，河 南鞏義市予華儀器有限責任公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海博迅GZX-9246MBE 型，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；電子分析天平，AL204 型，梅特勒 - 托利多儀器（上海）有限公司；同步輻射紫外真空 圓 二 色（synchrotron radiation circular dichroism， SRCD）光譜儀、同步輻射裝置（Beijing synchrotron radiation facility，BSRF）、4B8 真空紫外線站（vacuum ultraviolet，VUV），中國科學院高能物理研究所； 熒 光 光 譜 儀，LS-55 型， 美 國 珀 金 埃 爾 默 公 司； Materials Studio 材料模擬計算平臺，北京創騰科技有 限公司。
2.2 實驗方法
2.2.1 溶液的配制
木瓜蛋白酶和對氯汞苯甲酸用 pH=7.0 的磷酸鹽 （phosphate buffered saline，PBS）緩沖液分別配成質 量濃度為 1 mg/mL 木瓜蛋白酶溶液和濃度為 1×10-4 mol/L 的 CMBA 溶液。 將 1 mL 的木瓜蛋白酶溶液與 1 mL CMBA 溶液 混合，放入 40 ℃集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中，調 節轉速為 150 r/min，攪拌 4 h，以形成均勻的混合物， 用于 SRCD 及熒光光譜測定。
2.2.2 SRCD 分析
測定參數設置如下：環境溫度 25 ℃，光徑 0.1 mm，儲存環的電子能量 1.5 GeV，束流強度 450 mA，分辨率 1.0 nm，掃描范圍 172~260 nm，停留時 間 1 min。每組樣品測定 5 次，取平均值，記錄數據。 2.2.3 熒光光譜分析 測定參數設置如下：環境溫度 25 ℃，激發波 長 280 nm，激發與發射的狹縫寬度均為 5 nm，掃 描速度 500 nm/min，掃描范圍 310~400 nm。每組樣 品測定 5 次，取平均值，記錄數據。所得數據通過 CDTool 軟件處理，并用 CDPRO 分析軟件計算蛋白 質的二級結構，CD 信號范圍為 -1.8×10-2 ~1.8×10-2 deg·cm2 ·dmol-1 ，蛋白質的相對分子質量為 110 Da。
2.3 分子模擬
CMBA 與木瓜蛋白酶（papain，PaP）分子對接 操作流程按進行。木瓜蛋白酶晶體結構來 自 Brookhaven 蛋 白 質 數 據 庫（protein data bank 編 號：1CVZ），利用 PyMOL 軟件除去木瓜蛋白酶晶 體結構中與受體結合的原配體分子 C48 和水分子，并對受體蛋白進行加氫加電荷處理。利用 Materials Studio 的功能模塊 Discovery 優化對氯苯甲酸 （4-chlorobenzoic acid，PCBA）和 CMBA 的空間三 維結構。利用 AutoDock 4.2 中 AutoGrid 和 AutoDock 兩個程序對 PCBA、CMBA 與木瓜蛋白酶分子間的 相互作用進行模擬，并對其柔性受體與剛性配體間 的對接進行計算。對接時，受體大分子的格點盒子 大小為 60 nm×60 nm×60 nm，格點間距為 0.375 nm，盒子中心位于半胱氨酸（cysteine，Cys）25 的 巰基（—SH）上。運用 Lamarckian 遺傳算法與局部 能量搜索相結合，利用預設配置對剛性配體分子進行 精確對接，循環次數默認為 10 次。每次循環運算設 定為 100 次獨立對接實驗，且用半經驗勢函數作為能 量打分函數，通過計算確定配體分子在受體活性口袋 中可能的結合位置，并將對接結果進行成簇聚類分 析，其均方根（root mean square，RMS）在 2.0 Å 內 的對接結果歸為一簇。最終依據最低對接結合能和成 簇分析確定合理的木瓜蛋白酶與CMBA的結合模式， 獲得配體與受體蛋白的結合能量和對接作用模式圖， 計算氫鍵距離。
3 結果與討論
木瓜蛋白酶是一種重要的巰基蛋白，是由 212 個 氨基酸殘基組成的含 3 對二硫鍵的單鏈蛋白分子，其 一級結構中含 7 個 Cys 殘基，其中 6 個形成 3 對鏈 內的二硫鍵，另一個Cys25則作為活性位點的巰基。 木瓜蛋白酶具有典型的 α+β 折疊結構，由大小相當 的左右 2 個結構域構成，2 個結構域構成的裂隙為催 化活性中心，含有如下保守氨基酸殘基組成的催化 三聯體：Cys25- 組氨酸（histidine，His）159- 天冬 酰胺（asparagine，Asn）175。其中，左結構域（L域）由 10~111 和 208~212 氨基酸殘基組成，主要是 α螺旋結構，而右結構域（R- 域）由 1~9 和 112~207 氨基酸殘基組成，基本是 β- 折疊結構。SRCD 光 譜在光強度、偏振性和準直性方面均優于常規的圓 二色譜，尤其在 190 nm 以下短波長區域，能觀察 到更多細致的蛋白質二級結構。通過 CDPRO 中 SELCON3, CDSSTR 和 CONTINLL 三個軟件進行重 復擬合，確定最佳分析擬合軟件程序為 SELCON3。 SELCON3 軟件中選用的 IBasis6 算法可使實驗值與 計算值的均方根差和標準均方根方差皆小于 0.1，適用于木瓜蛋白酶二級結構模擬擬合。 遠紫外區（178~250 nm）是肽鍵的吸收峰
4 結語
利用 SRCD 和熒光光譜分析方法，結合 分子模擬技術研究了模擬生理條件下濃度為 1×10-4 mol/L 的 CMBA 對木瓜蛋白酶的作用機理。SRCD 和 Trp 熒光光譜分析結果表明，經 CMBA 處理前后木 瓜蛋白酶的構象和二級結構成分發生變化，一定程度 上揭示了 CMBA 作用下木瓜蛋白酶蛋白構象轉變的 機理。利用分子模擬研究 CMBA 和木瓜蛋白酶所形 成復合物的形態，利用成簇聚類分析判定兩者間的最 佳作用模式，進一步分析對接結果揭示了 CMBA 與 木瓜蛋白酶發生的相互作用，CMBA 與木瓜蛋白酶 活性中心 L- 域的 Gly66 和 Trp26 殘基間存在的氫鍵 和疏水作用，使 L- 域遭到破壞，導致 α- 螺旋結構 含量急劇降低，β- 結構含量增加，最終酶結構趨向 離散，天然構象遭到破壞，熒光猝滅，木瓜蛋白酶 失活。光譜表征分析和分子對接理論研究結果一致， 兩者相互補充，能夠從實驗和理論兩方面協同研究 CMBA 分子與木瓜蛋白酶之間的相互作用，為今后 進一步開展重金屬與生物大分子間的相互作用機理 提供一定的理論依據和參考。
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