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感染后咳嗽與氣道廣泛的炎癥密切相關。氣道 炎癥可由細菌或病毒介導，氣道炎癥反應時，氣道上皮 損傷，炎性細胞活化并浸潤于氣道，大量細胞因子和炎 性介質產生和釋放，使氣道壁神經暴露，并使以磷脂形 式存在于細胞膜上的花生四烯酸( AA) 在 PLA2 和 PLC 催化下，從磷脂池中釋放出來，在 AA 代謝酶的作 用下轉變為具有生物活性的代謝產物，發生 AA 的炎 癥級聯代謝。本課題組前期進行了射干的藥效學 實驗研究，結果表明: 射干具有抗炎、止咳、祛痰、增強 機體免疫功能、解熱、鎮痛、抑菌等藥理作用。通 過經典化學方法，對射干進行了分離，獲得了具有顯著 生理活性的異黃酮類化合物野鳶尾黃素。
1 材料與方法
1. 1 主要藥物與試劑
野鳶尾黃素( 100509) 均購于江蘇永健醫藥科技 有限公司。肺寧片購自吉林吉春制藥股份有限公司 ( 20140206) ; Hep － 2 人喉表皮癌細胞購自江蘇齊氏生 物科技 有 限 公 司; ＲSV 由中科院武漢病毒所贈予; DMEM 培養液和胎牛血清購自 COＲNING 公司; DMSO 購自美國 Sigma 公司; 胰酶和青鏈霉素購自中國醫學 科學院生物工程研究所; BCA 蛋白試劑盒購自 Beyotime 公司( Lot NO: P0012 － 1) ; 顯影粉、定影粉，購自 天津市世紀奧博商貿有限公司; protein loading buffer 購于北京全式金生物科技有限公司( Lot NO: 120703) ; T － bet 抗體購于美國 abcam 公司; GATA － 3 抗體購于 武漢博士德生物; 二抗( bs － 0295G － HＲP) 購于 bioss 博奧森。
1. 2 主要儀器
組織勻漿機( MagNA Lyser，瑞士羅氏) ; 噴霧儀 ( EM99 － 002，惠州斯萊達) ; 全自動模塊式血液體液分 析( XN － 1000，日本 Sysmex 公司) ; 熏煙箱( 自制) ; 三 氣培 養 箱 ( CB210，德 國 Binder) ; 倒置熒光顯微鏡 ( XDS － 500C，上海蔡康) ; 超凈工作臺( SW － CJ － 2D， 蘇州凈化) ; 低速離心機( BY － 400C，北京白洋) ; 立式蒸汽滅菌器( BXM － 30Ｒ，上海博訊實業有限公司醫療設備廠) ; 微型旋渦混合儀 ( XW － 80A，上海滬西) ; 分析天平( XS105，瑞士 Mettler － Toledo) ; 轉印槽( 170 － 390，美國 Bio － Ｒad) ; 電Q，德國默克) 等。
1. 3 實驗動物
SPF 級雄性豚鼠 40 只，體質量 250 ～ 400 g，購自 北京維通利華實驗動物技術有限公司，在遼寧省中醫 藥研究院( 遼寧中醫藥大學附屬第二醫院) 動物實驗 中心飼養，環境許可證號: SYXK( 遼) 2012 － 0003，濕 度 40% ～ 70% ，溫度 20 ～ 26 ℃，自由飲水。
1. 4 實驗方法
1. 4. 1 感染后咳嗽模型的建立
SPF 級雄性豚鼠在 SPF 級環境下飼養，空白對照組動物單獨飼養，在適應 新的環境 1 周后開始實驗，除空白組外，把其他組豚鼠 放入自制體積為450 mm × 450 mm × 900 mm 的煙熏箱 內，5 只一籠，一箱裝 6 籠，將 10 支新一品黃山牌香煙 點燃放入 50 g 刨花中產生煙霧，并置于自制煙熏箱 內，每日 1 次，每次持續煙熏 30 min，自由進食、飲水， 連續 7 d，分別于實驗的第 2、3 天，用乙醚淺麻醉豚鼠 后，經鼻腔滴入已事先擴增凍存好的滴度為 8 × 106 pfu /mL 的病毒液，滴入體積以體質量 1 μL /g 計算。
1. 4. 2 實驗動物分組及給藥方法
將 70 只 SPF 級豚 鼠適應性飼養 1 周后，隨機分為 7 組，即空白組、模型 組、中藥陽性組［肺寧片 512 mg /( kg·d) ］和野鳶尾黃 素組［48 mg /( kg·d) ］，每組 10 只。按“1. 4. 1”制備 感染后咳嗽動物模型，除模型組外，其它各給藥組在第 8 天時開始給藥，每天 1 次，連續給藥 7 d，空白組給予 等體積生理鹽水。
1. 4. 3 感染后肺組織
ＲSV 病毒檢測 將實驗豚鼠以 25 mg /kg 用 2% 戊巴比妥麻醉后，在無菌條件下取模 型組和空白組豚鼠約 100 mg 肺組織，加 PBS 溶液 1 mL 勻漿，勻漿機 6500 r/min，50 s，勻漿兩次后，離心機 2000 r/min 離心 10 min，加入鏈霉素溶液 10 μL，充分 混勻，用移液器仔細吸取上清 100 μL，接種于 Hep － 2 細胞上，在 DMEM 培養基( 含 2% 牛血清) 中生長，每 日仔細觀 察 病 變，若 有 特 征 性 病 變 出 現 者，確 定 為 ＲSV 陽性。
2 結果
細胞上培養至第 2 天可見細胞變化，逐漸腫脹、變 圓和聚集，細胞之間的間隙增大，第 4 天逐漸出現多核 巨細胞( 又稱融合細胞) ，提示 ＲSV 病毒感染成功 。全自動模塊式血液體液分析儀上測定各組豚鼠肺 泡灌洗液中白細胞總數、單核計數、淋巴細胞計數、嗜 酸性粒細胞計數及中性粒細胞計數，結果表明，模型組 肺泡灌洗液中中性粒細胞計數顯著高于空白組( P ＜ 0. 01) ，白細胞總數、淋巴細胞、單核細胞及嗜酸性粒 細胞計數顯著高于空白組，差異有統計學意義( P ＜ 0. 05) ，提示模型組豚鼠具有氣道炎癥。給藥后，野鳶 尾黃素對嗜酸性粒細胞有顯著抑制作用( P ＜ 0. 05) 。具有祛痰利咽、消癖散結、清熱解毒、消腫 止痛的功效，是中醫治療喉痹咽痛之要藥。有研究表明射干對炎癥早期和晚期均有明顯的抑制作用，野鳶尾黃素是射干中的活性成分，但目前 其治療感染后咳嗽和氣道炎癥尚無報道。本實驗采用 公認的 ＲSV 感染豚鼠的方法復制感染后咳嗽模型，采 用野鳶尾黃素進行治療，并通過枸櫞酸引咳觀察其鎮 咳作用，采用全自動模塊式血液體液分析儀檢測檢測 肺泡灌洗液中炎性細胞，采用 HE 法觀察對肺組織形 態學的影響，采用 ELISA 試劑盒法檢測肺泡灌洗液中 細胞因子，采用 Western Blot 法檢測 Th1 和 Th2 特異 性轉錄因子 T － bet 和 GATA － 3 蛋白的表達，揭示射 干不同異黃酮單體化合物抗氣道炎癥的作用及其機 制。
3 討論
感染后咳嗽又稱為“感冒后咳嗽”，是指呼吸道 感染發熱等急性期癥狀消失后，咳嗽仍遷延不愈，可持 續 3 ～ 8 周的時間，呈喉癢、干咳或咳少量白色黏液痰， 血常規、C 反應蛋白、胸片提示無異常，是呼吸道感染 后常見的并發癥。射干，是多年生草本鳶尾科植物 射干［Belamcanda chinensis( L. ) Ｒedouté］之干燥根莖， 最早記載于《神農本草經》。其味苦、辛，性寒，微毒，ＲSV 感染咳嗽模型。
