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華中枸骨 Ilex centrochinensis S． Y． Hu 又稱針齒冬青， 是冬青科冬青屬植物，主要生長在海拔 300 ～ 1 000 m 的山 坡和灌木叢中，廣泛分布于湖北恩施，其性味甘涼，具有 清熱解毒功效，藥用部位主要為根和葉，其中后者在民間 常被用來治療燙火傷，在其他地區也是制作苦丁茶的原料。目前發現，華中枸骨葉中主要含有萜類、有機酸、 黃酮類等成分，其中黃酮類具有廣泛生物活性，如抗氧 化、抗癌、抗菌等，但目前對該類成分的研究較少， 并且尚未涉及其提取工藝和抑菌作用
1 材料
1. 1 試藥
華中枸骨葉采自湖北省恩施市建始縣，經湖北 民族大學醫學部胡澤華博士鑒定為冬青科冬青屬植物華中 枸骨 Ilex centrochinensis S． Y． Hu 的葉，烘干后粉粹，過 60 目篩。蘆丁對照品 ( 上海金穗生物科技有限公司) 。MH 瓊 脂、MH 肉湯 ( 杭州微生物試劑有限公司) ; 金黃色葡萄球 菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、宋內志賀菌為湖北民族 大學醫學部微生物實驗室保存菌種。亞硝酸鈉、氫氧化鈉、 硝酸鋁、無水乙醇均為國產分析純。
1. 2 儀器
SSW 微電腦電熱恒溫水槽 ( 上海博迅實業有 限公 司 醫 療 設 備 廠) ; NU-425-400S 生 物 安 全 柜 ( 美 國 NuAire 公司) ; DFY-1000C 高速萬能粉粹機 ( 無錫沃信儀器有限公司) ; CL-32 L 高壓蒸汽滅菌器 ( 日本 ALP 公司) ; THC-10B 數控超聲波提取機 ( 濟寧天華超聲電子儀器有限 公司) ; ELJ-2800Ｒ 紫外可見分光光度計 ( 上海昂拉儀器有限公司) 。
2 方法和結果
稱取藥材粉末適量，25 ℃ 下按 液料比 10 ∶ 1 加入 60%乙醇，置于超聲波提取機 ( 功率 480 W) 中提取 10 min，提取液過濾，濾渣在相同條件下 再提 取 1 次，合 并 2 次 濾 液，離 心、濃 縮，加 水 定 容， 即得。配制 0. 1 mg /mL 蘆丁對照品溶 液，分別取 0、1、2、3、4、5 mL 于 10 mL 量 瓶 中，加 30%乙醇至 5 mL，加入 5%亞硝酸鈉 0. 3 mL，搖勻，放置 6 min，加入 10%硝酸鋁 0. 3 mL，搖勻，放置 6 min，加入 1 moL/L 氫氧化鈉 4 mL，加水定容至 10 mL，搖勻，放置 15 min，于 510 nm 波長處測定吸光度。以溶液質量濃度為 橫坐標 ( X) ，吸光度為縱坐標 ( A) 進行回歸，得到方程 為 A = 10. 17X + 0. 015 3 ( Ｒ = 0. 999 7 ) ， 在 0. 010 ～ 0. 050 mg /mL范圍內線性關系良好。取對照品溶液，按 “2. 1. 2”項下方 法測定 6 次，測得吸光度 ＲSD 為 0. 19%，表明儀器精密度 良好。精密量取總黃酮含有量已知的供 試品溶液 6 份，加入對照品溶液，測得蘆丁平均加樣回收率為 99. 78%，ＲSD 為 1. 35%。固 定 提 取 時 間 10 min，液 料 比 10 ∶ 1，加入 40%、50%、60%、70%、80%乙醇，測定總 黃酮含有 量，結 果 見 圖 1。由 圖 可 知，乙醇體積分數在 40% ～ 60%范圍內總黃酮含有量逐漸提高，60%時最高，但 進一步增加后反而下降，這是因為乙醇體積分數升高，其 極性也會隨之改變，根據相似相溶原理，從藥材中溶出的 總黃酮量也會有所變化，同時醇溶性雜質溶出量也會增加， 會與總黃酮競爭性地與乙醇-水分子結合，導致后者溶解度 降低，含有量下降。因 此，確定最佳乙醇體積分數 為 60%。
3 討論
在優化工藝 ( 提取溫度 25 ℃，超聲功率 480 W，乙醇 體積分數 55%，液料比 25 ∶ 1，提取時間 30 min，提取次 數 2 次) 下，華中枸骨葉總黃酮提取物對金黃色葡萄球菌、 大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、宋內志賀菌有一定抑制作用， 并呈濃度依賴性。近年來隨著抗生素大量不合理使用，耐 藥菌株越來越多，但細菌對有抗菌作用中草藥產生耐藥性 的速度慢于對抗生素的，而且容易消失，故本實驗也可 為臨床上防止菌株產生耐藥性提供新思路。
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