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蛋白酶在科學研究和工業生產等方面應用廣 泛（唐兵等，2000），其主要產自微生物，但在高溫、 強酸、強堿、多金屬離子等條件下酶的催化活性并 不好，常有失活情況發生（林影等，2000）。 高溫蛋 白酶的應用前景十分廣闊（廉立慧等，2011），但國 內對高溫蛋白酶產生菌的研究相對較晚， 對高溫 蛋白酶催化活性方面的研究還鮮有報道。
1 材料和方法
1.1 試驗材料
1.1.1 土壤樣品
土壤樣品來自大理彌渡縣白總 旗熱泉的底泥，熱泉水溫 55 ℃。
1.1.2 主要儀器
顯微鏡（奧林巴斯）；紫外可見 光分光光度計（上海菁華儀器公司）；高速冷凍離 心機（上海安亭科學儀器公司）；恒溫培養箱（上海 一恒科學儀器有限公司）；水浴恒溫搖床（常州國 華電器有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；超凈工作臺（蘇州凈 化設備有限公司）；PCR 擴增儀（美國 ABI）；電泳 儀（北京六一生物科技有限公司）。
1.1.3 試劑
酵母抽提物、蛋白胨為英國進口；瓊 脂粉為西班牙進口分裝；脫脂奶粉、三氯乙酸、folin 試劑、濃鹽酸、干酪素、氯化鈉、結晶紫、碘、乙醇、 孔雀綠、番紅等均為國產分析純試劑。DNA 抽提試 劑盒、PCR 擴增試劑盒、 膠回收試劑盒和 DNA 分 子量標準品均購自北京天根生物技術有限公司。
1.1.4 培養基
脫脂奶粉培養基：脫脂奶粉 50 g， 水 500 mL，瓊脂粉 10 g，100 ℃滅菌 20 min。 LB 液體培養基：胰蛋白胨 10 g，酵母浸出物 5 g，NaCl 10 g， 超純 水 1000 mL， 調 pH 至7.2， 121 ℃滅菌 20 min。 發酵產酶培 養基：豆粕 20 g，葡萄糖 1 g，蒸 餾水 200 mL，121 ℃滅菌 20 min。
1.2 試驗方法
1.2.1 菌株富集
稱取白總旗熱泉底泥 2 g 于 45 mL 的無菌蒸餾水中，150 r/min，振蕩 15 min。在無 菌條件下， 用移液槍吸取 5 mL 懸液于 50 mL 的 富集培養基中，將接種好的富集培養基置于 55 ℃， 轉速為 150 r/min 的水浴恒溫振蕩培養箱中振蕩 培養 24 h。
1.2.2 菌株初篩
將富集好的菌液稀釋至 10-3 、 10-6 、10-9 倍， 用移液槍分別吸取稀釋的菌液 150 μL 接種在篩選培養基平板上，涂布均勻。 于 37 ℃倒 置培養 24 h。 觀察菌落周圍若有水解圈出現，說 明該菌株能產生蛋白酶。
1.2.3 菌株復篩
將初篩得到的菌株取少量接種 于種子瓶（LB 液體培養基），55 ℃培養 24 h 后，將 種子液按 2%的接種量接入到發酵培養基，55 ℃、 150 r/min 水浴搖床培養一周。 離心取上清測酶活。
2 結果與分析
2.1 產酶菌株的篩選
根據水解圈直徑與菌落 直徑比值的大小。篩選到 3 株產高溫蛋白酶菌株。 其中 1 號菌株 水解圈直徑 與 菌 落 直 徑 比 值（R1/ R2）最大。 經復篩發現 3 株菌均為分泌型蛋白酶 產生菌，且 1 號菌株酶活最高，為 49.99 U/mL，與 初篩的結果相符。因此，選擇 1 號菌株作為后續試 驗研究菌株，命名為 Pro-55。
2.2 菌種鑒定
2.2.1 形態學、 生理生化特征
Pro-55 在 LB 培 養基上 37 ℃培養 72 h 后， 菌落形態呈圓形，黃 色，不透明，黏稠，光滑，表面濕潤，中間隆起，邊緣 整齊， 菌落整體較小未產菌絲。 革蘭氏染色呈陽 性，端生芽孢，鞭毛染色后未觀察到鞭毛。 對 Pro-55 的生 理 生 化 特 性 進 行 研 究 發 現， V-P 試驗、甲基紅試驗、蔗糖發酵試驗結果均為弱 陽性。明膠試驗、吲哚試驗、乳糖發酵試驗、葡萄糖 發酵試驗結果均為陰性。
2.2.2 16S rRNA 基因序列及系統發育分析
16S rRNA 基因測序， 所獲得的序列長度為 1438 bp， 將 Pro-55 的 16S rRNA 基因 序 列 與 GenBank 數 據庫中的序列進行同源性比對，發現 Pro-55 與短 芽 孢 桿 菌 屬 的 16S rRNA 基 因 序 列 自 然 聚 類 ， Pro-55 的 16S rRNA 基因序列與 16 條相似性較 高的序列構建系統發育樹見圖 1， 從圖中可以看 出 Pro -55 與 Brevibacillus sp. FJAT -21992 （KP728965.1）菌株聚為一群，相似性也最高，表明 Pro-55 與 Brevibacillus sp.的菌株親緣關系最近。 根據 Pro-55 的形態及生理生化特征， 結合 《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第八版）（布坎南，1984）， 以及 Pro-55 16S rRNA 基因序列及系統發育樹， 將 Pro-55 初步鑒定為短芽 孢桿菌屬（Brevibacillus sp.） 的一 株 菌， 命 名 為 Brevibacillus sp.Pro
2.3 菌種的最適生長溫度
按照試驗方法，在波 長 600 nm 處測定不同溫度培養下 LB 培養基的 吸光值，以 600 nm 處的吸光值為縱坐標，溫度為 橫坐標作溫度—吸光值關系曲線，結果如圖 2。
從圖 2 可知，25 ～ 43 ℃菌株的生長量隨著溫 度 的 升 高 而 增 加，43 ℃時，LB 培養 基 在 600 nm 下的吸光值最高，表明 43 ℃是菌株的最適生長溫 度。 45 ℃以后，菌株生長量隨著溫度的升高而下 降，菌株在 55 ℃下仍能生長，表明菌株屬于典型 的耐高溫菌。
3 結論
高溫蛋白酶是一類廣泛應用于醫藥、食品、日 用化工等方面且有著巨大開發潛力的酶， 在微生 物體內廣泛 存在 （徐輝 艷 等，2009； 胡青 平 等， 2005）。 本次試驗得到的菌株經分子鑒定為短芽 孢桿菌；其最適生長溫度為 43 ℃，酶反應最適溫 度 40 ℃，酶反應最適 pH 為 6.0，在最適反應溫度 下酶活力為 36.74 μg/mL； 在 37 ℃以下酶具有較 好的熱穩定性。 Ca2+ 、Zn+ 、Mg2+ 、Cu2+ 等離子對酶液 的酶活性均有促進作用， 同時酶液具有很強的離 子耐受力。本文所篩選菌株在 55 ℃高溫下依然具 有較強的酶活力，且溫度耐受性較強。
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