細胞懸浮培養體系建立（博訊YXQ-50SII滅菌器使用

樟葉越桔 ( Vaccinium dunalianum Wight) 為杜 鵑花科 ( Ericaceae) 越桔屬 ( Vaccinium) 植物， 主要分布于我國西南地區，以及越南、不丹、印度 東北部等地。其幼嫩葉芽在云南彝族民間被稱為 “雀嘴茶”，據記載自明代開始就作為一種茶代用品飲用至今。程桂廣等、楊芳等和羅旭璐 等等先后對雀嘴茶進行了營養成分的分析和評 價，發現雀嘴茶中含有 17 種氨基酸、10 種常量和 微量元素，具有明顯的高鉀低鈉特征，并含有粗纖 維、黃酮類、Vc 和多糖等多種營養物質。近年來，作為 21 世紀天然、安全、高效的美白活性 添加劑的熊果苷，已廣泛應用于化妝品等相關 領域。

1 材料與方法

1. 1 材料與試劑

1. 1. 1 植物材料

采用研究組前期培養的樟葉越桔組培苗， 挑選健壯且莖未木質化的瓶苗為試驗材料，其原始 植物材料于 2013 年 5 月采自云南省楚雄彝族自治 州武定縣。

1. 1. 2 試驗試劑及儀器

試劑 WPM 木本植物培養基母液，包括大量元 素組、鈣鹽組、鐵鹽組、微量元素組、有機物組; 蔗糖，瓊脂，玉米素 ( ZT) ，萘乙酸 ( NAA) ，6-芐氨基腺嘌呤 ( 6-BA) ，2，4-二氯苯氧乙酸 ( 2，4-D) 。 儀器 萬分之一電子天平 AＲ224CN 型 ( 上海 奧豪斯 儀 器 有 限 公 司) ，立式壓力蒸汽滅菌器博迅YXQ-LS-50 SII 型 ( 上海博訊實業有限公司醫療設 備廠) ，超凈工作臺 SW-CJ-2FD ( 蘇凈集團蘇州安 泰空氣 技 術 有 限 公 司) ，電熱恒溫鼓風干燥箱 DHG-9053 型 ( 上海一恒科技有限公司) 。100mL 廣口錐形瓶，0. 22μm 無菌透氣封口膜，鑷子、手 術刀、不銹鋼稱量勺。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 愈傷組織誘導條件的篩選

配制誘導培養基 采用 WPM 木本植物培養 基，其中添加蔗糖 30g /L，瓊脂 4. 5g /L。根據越桔 屬其它植物的相關，設計 6-BA、NAA 和 2，4-D 的 4 種激素配比。 取生長健壯、未木質化、葉片大小適中的組培 苗，摘取中靠近頂端的幼嫩葉片，用手術刀在葉片 表面劃出若干劃痕，每瓶放置 3 片葉片。每組取 5 瓶為光培養，條件為，光照強度 30－50μmol /m2 ·s， 光照周期為 12h /d; 另外 5 瓶為暗培養。培養溫度 為 25±2℃。每周觀察記錄其生長狀況，共計觀察 8 周。

1. 2. 2 愈傷組織增殖條件的篩選

配制增殖培養基 采用 WPM 木本植物培養 基，添加蔗糖 30g /L，瓊脂 4. 5g /L。前期預試驗發 現半固體培養基中，ZT 與 NAA 濃度為 5 ︰ 1 時利 于愈傷組織生長。由于高濃度激素有利于促生蓬松 狀愈傷組織，而過高濃度反而抑制愈傷組織生長， 故設 計 4 組 濃 度 梯 度，第 1 組 的 激 素 配 比 為 1. 0mg /L ZT + 0. 2mg /L NAA; 第 2 組為 1. 5 mg /L ZT + 0. 3mg /L NAA; 第 3 組 為 2. 0mg /L ZT + 0. 4 mg /L NAA; 第 4 組 為 2. 5 mg /L ZT + 0. 5mg /L NAA，以此探究樟葉越桔愈傷組織適宜的增殖培養 條件。 挑選淺黃色半透明無褐化生長良好的愈傷組 織，切成較小的塊，如愈傷組織足夠蓬松、大小適 宜，可輕輕掰下，以減少切面損傷，減少后期褐化 現象。轉移至新培養基時保持愈傷原有的上下相 位，每瓶培養基接種 4－5 塊愈傷組織。采用暗培 養的方式培養，培養溫度為 25±2℃。每周觀察記 錄其生長狀況，培養至愈傷組織呈現蓬松狀態。

1. 2. 3 懸浮培養體系的建立

配制液體培養基 采用 WPM 木本植物培養基， 添加 蔗 糖 30g /L，激 素 為 2. 0mg /L ZT + 0. 4mg /LNAA，調節 pH 4. 8－5. 2。將培養基分裝至 100mL 廣口三角瓶中，每瓶培養基 50mL，用 0. 22μm 無 菌透氣膜封口。 為探究最適宜轉移至液體培養基中建立懸浮培 養體系的愈傷形態，在培養過程中選擇不同形態 的、滿足前人經驗的適宜建立懸浮體系的愈傷組 織，分別轉移至液體培養基中進行懸浮培養。包 括:
( 1) 淺黃色表面干燥半透明疏松態愈傷組織;
( 2) 淺黃色半透明顆粒狀愈傷組織;
( 3) 能自行 分散成近粉末狀的淺黃色半透明愈傷組織。轉移至 液體培養基中培養 3 代以上，觀察其是否適宜建立 懸浮培養體系。

2 結果與分析

不同激素配比的 A、B、C、D 4 個處理先后均可產生愈傷組織，但隨著培養時間 的延長各組愈傷組織的生長狀況各有不同，并發現 不同光照條件下誘導的葉片愈傷組織無明顯差異。 其中，A 處理和 D 處理最終產生穩定的半透明、 活性較強、褐化現象不明顯的愈傷組織，最適宜后 續試驗需要?？紤]到 A 處理愈傷組織的產生速度 和增殖速度高于 D 處理，且愈傷組織質量差異較 小，故采用 A 處理作為誘導愈傷組織的激素配比。將 A 處理誘導所得的半透明、無褐化、質量 較好的愈傷組織通過繼代的方式轉移到所設置愈傷 組織增殖的 4 組增殖培養基中，培養至 3 個月，每 組愈傷組織均生長良好，蓬松度較好，但第 3 組的 愈傷組織除呈現半透明蓬松狀態，還能在邊緣處出 現能自行分散成小顆粒的愈傷組織，其余 3 組其愈 傷組織的蓬松度均不如第 3 組。因此，第 3 組的激 素濃度配比 ( 2. 0mg /L ZT+0. 4mg /L NAA) 最適宜 培養用于懸浮培養的愈傷組織。

3 結論與討論

植物生長調節劑是影響愈傷組織誘導和增殖的 重要因素。本試驗發現樟葉越桔愈傷組織誘導的最 佳配比為 2. 0mg /L 6-BA+0. 05mg /L NAA+2. 0mg /L 2，4-D) ，所誘導出的愈傷組織質量較好，為半透 明黃色，無褐化現象產生。這一結果與同屬植物矮 叢藍莓 ( V. angustifolium Aiton) 葉片誘導愈傷的結 果相符。對高灌藍莓 ( V. corymbosum Aiton) 的 一些研究表明，6-BA 與愈傷組織的產生和質量呈 正相關關系，當 6-BA 處于高濃度條件下，可 直接從莖段和葉片誘導得到愈傷組織。本試驗也取 得類似的結果，當 6-BA 的添加濃度為 2. 0mg /L 和 1. 0mg /L 時，誘導所得的愈傷組織的質量和速度均 優于添加濃度為 0. 5mg /L 6-BA 的情況。ZT 對越桔 屬植物組培苗有較好的促生長效果，且 ZT 和 NAA 配合使用能有效地促進愈傷組織的誘導和分化，本試驗篩選出的 2. 0 mg /L ZT + 0. 4 mg /L NAA 激素配比條件下得到的樟葉越桔愈傷組織質 量較好并呈蓬松狀態，符合后續細胞懸浮培養的要求。



 

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