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醬油是以大豆（豆粕）和小麥等為主要原料，添加 米曲霉固態制曲和液態醬醪發酵制備的一種色、香、味 俱全的液體調味品。液態醬醪釀造過程中，各種微生 物的生理代謝和酶系的生化作用，使原料中蛋白質、淀粉、油脂等大分子被分解為小分子肽、游離氨基酸、有 機酸等小分子物質，賦予醬油豐富飽滿的滋味和獨特 的香氣。
１ 材料與方法
１．１ 試驗材料
米曲霉曲精（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）：山東市濟寧玉 園生物科技有限公司；低溫食用豆粕：山東市禹王實業 （集團）有限公司；原料面粉、食鹽：均為市售。
１．２ 試驗試劑
十二 水 合 磷 酸 氫 二 鈉、二水合磷酸二氫 鈉、濃 硫 酸、檸檬酸（一水）、三氯乙酸、乳酸、乳酸鈉、氫氧化鈉、 鹽酸、甲醛及苯酚：均為分析純；谷氨酰胺、酪蛋白及福 林酚試劑：均為生化試劑；肽分子量標品：色譜純，購自 美國Ｓｉｇｍａ公司。
１．３ 試驗主要儀器設備
ＨＹＰ－３０８消化爐、ＫＤＮ－１０３Ｆ 自動定氮儀 上海 纖檢 儀 器 有 限 公 司；Ｂａｎｔｅ３２１－ＮＨ４ 銨 離 子 選 擇 電 極 上海 般 特 儀 器 有 限 公 司；ＨＨ－４ 數 顯 恒 溫 水 浴 鍋 江陰市保利科研器械有限公司；ＭＥ２０４Ｅ 分析天 平 梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；高效液相色 譜儀 美 國 Ｗａｔｅｒｓ 公 司；ＴＳ１００ 微 型 旋 渦 混 合 儀 器 杭州瑞誠 儀 器 有 限 公 司；ＤＨＧ－９０７０Ａ 鼓 風 干 燥 箱 上?；?泰 儀 器 制 造 有 限 公 司；ＧＬ２１Ｍ 高 速 冷 凍 離心 機 長 沙 湘 智 離 心 機 儀 器 有 限 公 司；上海博迅BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器； ＺＸＪＰ－Ａ１４３０霉菌培養箱 上海智誠分析儀器制造有 限公司。
１．４ 試驗方法
１．４．１ 主要工藝流程
本文采用高鹽稀態醬油釀造方法（ＧＢ１８１８６－２０００）進行發酵，按１∶２．５（大 曲∶水）混 合 均 勻 后，在４ ℃ 冰箱進行醬醪發酵初期（９ｄ）的控溫發酵，然后與１６％ （Ｗ／Ｗ）的鹽混合，放在２５ ℃的恒溫發酵箱中進行保 溫 發 酵。 其 中 一 部 分 每 ２～３ ｄ 用 １０ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 調控醬醪ｐＨ 值在６．５左右，為調控ｐＨ 醬醪； 另外一部分在自然 ｐＨ 值下進行發酵，為自然 ｐＨ 醬 醪。醬醪發酵的總周期為９０ｄ。醬油制備的主要工藝 流程見圖１。
１．４．２ 谷氨酰胺酶活力和蛋白酶活力的測定
參考崔春等和 Ｎａｎｎｉｐｉｅｒｉ等的 方 法，采 用 離 子選擇 電 極 法 測 定 谷 氨 酰 胺 酶 活 力。 參 照 ＳＢ／Ｔ １０３１７－１９９９《蛋白酶活力測定法》，采用福林酚法測定 蛋白酶活力。
１．４．３ 總氮和氨基酸態氮的測定
參照國家標準 ＧＢ１８１８６－２０００《釀造醬油》，采用 凱氏定氮法測定樣品中的總氮含量，采用甲醛滴定法 測定氨基酸態氮含量。
１．４．４ 水溶性分子肽的分子量分布
采用凝膠色譜法測定肽分子量的分布。檢測條件為 Ｗａｔｅｒｓ６００型高效液相色譜儀，ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬ凝 膠色譜分析柱；洗脫液為含有０．１％三氟乙酸的磷 酸 鹽緩沖液，流速為１ｍＬ／ｍｉｎ，檢測波長為２２０ｎｍ。標 準肽樣品相對分子質量的對數值與洗脫體積擬合直線 方程為 ｙ＝ －０．３５１ｘ＋７．６７７（Ｒ２ ＝０．９９２１），式 中： ｙ為標準肽分子量的對數；ｘ為保留時間。
１．４．５ 感官評價分析
采用定量 描 述 分 析（ＱＤＡ）方 法。感 官 評 定 小組由７名男生和５名女生（年齡在２５～４５歲）組成， 評價前對每位評價人員進行多次風味描述一致性的認 定培訓。感官測評的標 準溶液為 ５ 種：甜 味 （蔗 糖， １％）、咸味（氯化鈉，０．７％）、鮮味（谷氨酸鈉，０．３５％）、 苦味（Ｌ－異亮氨酸，０．５％）、酸味（檸檬酸，０．０８％）。感 官評價采用 九 點 線 性 標 度 法，０～９ 分分別表示無感 覺、閾值感覺、感覺微弱、感覺中等、感覺強烈，采用雷 達圖描述評價結果。
１．５ 數據分析
試驗結果以兩組發酵樣平均數±標準差來表示， 所有試驗均重復３次，使用 ＳＰＳＳ１６．０和 Ｅｘｃｅｌ２０１６ 軟件分析數據并繪制相應圖表。
２ 結果與討論
濾渣中谷氨酰胺酶活力的變化趨勢 與濾液中的變化趨勢相似，也呈現出先快速下降后緩 慢下降，最后趨于消失的變化趨勢。整體上，濾渣中調 控ｐＨ 的谷氨酰胺酶活力大于自然ｐＨ 的谷氨酰胺酶 活力。濾渣中的谷氨酰胺酶主要為不溶性的胞內酶。 隨著發酵時間延長，微生物的新陳代謝作用產生多種 有機酸，韓銘海等通過篩選獲得一株高產谷氨酰胺 酶菌 株，其 產 酶 的 最 適 ｐＨ 為 ６．２，在 ｐＨ＜５．８ 或 ｐＨ＞６．８時，谷氨酰胺酶活力顯著下降，這與我們的試 驗結果 基 本 一 致。所 以，在 發 酵 時 適 當 調 整 醬 醪 的 ｐＨ 值，可以保持谷氨酰胺酶活力。兩個樣品的中性蛋白酶活力均呈現 出先急速下降后緩慢下降的趨勢。發酵０～１ｄ，不同 醬醪ｐＨ 發酵過程濾液中的中性蛋白酶活力均迅速下 降（Ｐ＜０．０５），但降幅相似。發酵１～１０ｄ，低溫脅迫、 無鹽發酵下，微生物得到充分的生長，各醬醪ｐＨ 發酵 的蛋白酶活力有輕微的提高。發酵１０～９０ｄ，蛋白酶 活力下降緩 慢，樣 品 間 差 異 顯 著（Ｐ＜０．０５）。至 發 酵 ９０ｄ，酶 活 力 很 弱，這可能與中性蛋白酶對不同醬醪 ｐＨ 的適應程度不同有關。
３ 結論
不同醬醪ｐＨ 發酵的醬油其谷氨 酰 胺 酶、蛋 白 酶 活力差別顯著（Ｐ＜０．０５）。隨 著 發 酵 時 間 的 延 長，醬 醪ｐＨ 不斷下降至５．０以下，谷氨酰胺酶和蛋白 酶 活 力均不斷降低。持續調控醬醪ｐＨ 在６．５附近，處 于 谷氨酰胺酶和蛋白酶的最適ｐＨ 范圍，有利于 保 留 酶 的活力，使原料分解得更充分。兩個醬醪ｐＨ 發 酵 的 醬油其全氮、氨基酸態氮均在發酵初期快速上升，樣 品間無顯著性 差 異（Ｐ＞０．０５）。至 發 酵 第 ９０ 天，調 控ｐＨ 和自然ｐＨ 的全氮、氨氮均達到了特級醬油的 標準（全氮≥１．５０ｇ／ｄＬ，氨 基 酸 態 氮≥０．８０ｇ／ｄＬ）。 不同醬醪ｐＨ 發酵的醬油其肽分子量分布主要集中 于１～５ｋＤａ（＞５０％），不同肽段所占比例不同。至 發酵第９０天，調 控 ｐＨ 發 酵 醬 油 其 大 于５ｋＤａ肽 段 所占比例低于自然ｐＨ 發酵醬油，而具有重要 呈 味 作 用的１～５ｋＤａ肽 段 所 占 比 例 高 于 自 然 ｐＨ 發 酵 醬油，且差異顯著（Ｐ＜０．０５）。不 同 醬 醪 ｐＨ 發 酵 的 醬 油的滋味有明顯差異，調控ｐＨ 的鮮味、厚味、咸 味 最 為突出，苦味 最 弱；自 然 ｐＨ 的 甜 味 較 為 突 出，鮮 味、 厚味也較好，但有較強的 苦 味。調 控 醬 醪 ｐＨ 在６．５ 附近發酵的醬 油 相 對 于 自 然 醬 醪 ｐＨ 下 發 酵 的 醬 油 滋味更加濃郁。
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