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卵巢癌為高度異質性腫瘤，在婦科惡性腫瘤發生率排名中位居第三（排名前兩位的依次為子宮內膜癌和宮 頸癌），致死率則居婦科惡性腫瘤之首。根據統計資料顯示，全世界每年診斷出的卵巢癌患者約有２３９０００例， 而死于卵巢癌的患者約有１５２０００人。
１材料與方法
１．１ 材料
成年尖吻蝮蛇購自湖南省湘西土家族苗族自治州烏龍山，采用咬皿法制備蛇毒，經冷凍干燥后置于－２０ ℃ 低溫保存備用。Ａ２７８０細胞購買于 ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）。
１．２ 儀器與試劑
本研究所用的主要儀器為：ＧＩ５４Ｄ高壓滅菌器（美國 ＺＥＡＬＷＡＹ 公司）、高溫烘烤箱（上海精宏實驗設備有 限公司）、超凈工作臺（上海博訊實業有限公司）、ＴＧＬ－１６Ｂ臺式離心機（上海迪索儀器有限公司）、ＭＣＯ－１５ＡＣ二 氧化碳培養箱（日本ＳＡＮＹＯ 公司）、ＴＨ４－２００倒置熒光顯微鏡（日本 ＯＬＹＭＰＵＳ公司）、ＴＧＬ－２０高速冷凍離心 機（四川蜀科儀器有限公司）和酶聯免疫檢測儀（美國 Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司）。主要耗材與試劑為：２５ｃｍ２ 細胞培養瓶和 細胞培養板（美國 Ｃｏｒｎｉｎｇ公 司）、細 胞 計 數 板（上海新睿生物科技有限公司）、Ｂａｓａｌｍｅｄｉｕｍ／ＤＭＥＭ－Ｈ（美 國 Ｇｅｎｖｉｅｗ 公司）、ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ－８（美國 Ｇｅｎｖｉｅｗ 公司）、ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ（美國 Ｓｉｇｍａ公司）、青霉素－鏈霉 素（美國 ＨｙＣｌｏｎｅ公司）、ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）（美國 ＨｙＣｌｏｎｅ公司）和 Ｔｒｙｐｓｉｎ０．２５％（１×）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （美國 ＨｙＣｌｏｎｅ公司）。
１．３ 方法
１．３．１ 細胞培養
培養 Ａ２７８０細胞時，培養液選擇 ＤＭＥＭ 培養基加質量分數為１０％的 ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ 和 １００Ｕ·ｍＬ－１的青霉素－鏈霉素，置于３７℃、體積分數為５％的ＣＯ２ 以及飽和濕度的培養箱中培養。Ａ２７８０細胞 呈貼壁生長。后續實驗中，有關 Ａ２７８０細胞的培養液配方以及培養箱中的理化參數均保持不變。
１．３．２ 不同質量濃度蛇毒對 Ａ２７８０細胞的形態學影響
采用徐平等人的方法并稍作修改：取對數期生長的 Ａ２７８０細胞，經胰酶消化成懸液，使細胞密度為２．５×１０５個·ｍＬ－１，接種于２４孔板中，置于培養箱中培養；細胞 貼壁后棄上清，用ＰＢＳ清洗１次，每孔加入９００μＬ培養液，再加入不同質量濃度的蛇毒樣品各１００μＬ，使蛇毒的 終質量濃度分別為３．１２５，６．２５，１２．５，２５，５０，１００和２００μｇ·ｍＬ－１，而空白對照（蛇毒質量濃度為０）加入等量的 ＰＢＳ，置于培養箱中培養１２ｈ，之后拍照記錄細胞形態變化。
１．３．３ 不同蛇毒作用時間對 Ａ２７８０細胞的形態學影響
仍然采用徐平等人的方法并稍作修改，且在加入蛇毒 前的操作步驟同１．３．２部分；然后加入蛇毒１００μＬ 使蛇毒的終質量濃度為５０μｇ·ｍＬ－１，以未加蛇毒為對 照 （即０ｈ），置于培養箱中培養１，６，１２ｈ，并在以上時間點拍照記錄細胞形態變化。
１．３．４ 蛇毒對 Ａ２７８０細胞增殖活力的影響
采用ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ－８（ＣＣＫ－８）試劑盒檢測蛇毒對 Ａ２７８０細胞增 殖能力的影響，根據試劑盒說明書進行如下操作：取對數期生長的 Ａ２７８０細胞，經胰酶消化成懸液，使細胞密度 為２．５×１０５個·ｍＬ－１，接種于９６孔板中，置于培養箱中培養，細胞貼壁后棄上清；用 ＰＢＳ清洗１次，每孔加入 ９０Ｌ培養液，再加入不同質量濃度的蛇毒樣品各１０μＬ，使蛇毒的終質量濃度分別為３．１２５，６．２５，１２．５，２５，５０， １００和２００μｇ·ｍＬ－１，空白對 照（蛇毒質量濃度為 ０）加 入 等 量 的 ＰＢＳ，每 組 ６ 個 復 孔；再 置 于 培 養 箱 中 培 養 １２ｈ，每孔加入１０μＬＣＣＫ－８，在培養箱中孵育１ｈ；酶聯免疫檢測儀于４５０ｎｍ 波長檢測吸光度，采用以下公式進 行細胞增殖活力的計算： Ｖ＝Ａ２－Ａ０ Ａ１－Ａ０ ×１００％。 其中：Ｖ 為細胞增殖活力；Ａ０ 為有培養基、ＣＣＫ－８但無培養細胞孔的吸光度；Ａ１ 為有培養細胞、ＣＣＫ－８、ＰＢＳ孔 的吸光度；Ａ２ 為有培養細胞、ＣＣＫ－８溶液、蛇毒樣品孔的吸光度。
１．３．５蛇毒對 Ａ２７８０細胞粘附能力的影響
在李博等人方法基礎上稍作修改：取對數期生長的 Ａ２７８０細胞， 經胰酶消化成懸液，使細胞密度為２．５×１０５個·ｍＬ－１，接種于２４孔板中，加入１００μＬ 不同質量濃度的蛇毒樣 品使得蛇毒終質量濃度分別為３．１２５，６．２５，１２．５，２５，５０，１００和２００μｇ·ｍＬ－１，空白對照（蛇毒質量濃度為０）加 入等量的ＰＢＳ，輕輕搖勻，置于培養箱中孵育１２ｈ；再用ＰＢＳ清洗兩次，于顯微鏡下拍照，并隨機選擇３個視野進 行計數（放大倍率為１０×２０倍），以粘附率來表示 Ａ２７８０細胞的粘附能力：其中：Ｒ 為粘附率；Ｑ１ 和Ｑ０ 分別為蛇毒處理后的培養細胞數量和空白對照的培養細胞數量。
１．３．６ 數據統計
本研究所得數據均用ｘ珚±ｓ表示，采用ＳＰＳＳ１８．０軟件對細胞增殖活力、粘附率等數據進行單 因素方差分析，當ｐ＜０．０５時，分析結果具有統計學意義。
２結果與分析
不同質量濃度的尖吻蝮蛇毒作用于 Ａ２７８０細胞１２ｈ后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態。結果顯示：空 白對照 Ａ２７８０細胞貼壁良好，輪廓清晰，分布均勻，呈規則形態；當蛇毒質量濃度為３．１２５μｇ·ｍＬ－１時， Ａ２７８０細胞皺縮、變圓，出現少量凋亡的現象；隨著蛇毒質量濃度的增加，大量 Ａ２７８０細胞皺縮、變圓、黏 連成團，出現明顯的凋亡現象。以上結果說明尖吻蝮蛇毒可誘導 Ａ２７８０細胞凋亡，且兩者呈劑量依賴 關系，即：蛇毒劑量越大，細胞凋亡現象越明顯。為探究不同時間條件下尖吻蝮蛇毒對 Ａ２７８０細胞的形態學影響，選用５０μｇ·ｍＬ－１的蛇毒作用于 Ａ２７８０ 細胞，結果如圖２所示：未加蛇毒時，Ａ２７８０細胞貼壁良好，輪廓清晰，分布均勻，呈規則形態；當蛇毒處理 Ａ２７８０細胞１ｈ時，少量被處理細胞出現皺縮、變圓的現象；當蛇毒處理 Ａ２７８０細胞６ｈ時，大量被處理 細胞皺縮、變圓的現象；當蛇毒處理 Ａ２７８０細胞１２ｈ時，被處理細胞粘連成團并大量出現凋亡現象。以 上結果說明尖吻蝮蛇毒誘導 Ａ２７８０細胞凋亡的時間越長，細胞凋亡現象越明顯。
３討論
腫瘤細胞主要特征是無限增殖、侵襲和轉移。腫瘤細胞侵襲和轉移機制復雜，涉及許多調控因子、細胞因子 等之間的相互作用———這是導致腫瘤惡性發展的主要原因。細胞之間粘附能力的變化是細胞轉移的初始階段， 并有助于腫瘤細 胞 從 原 發 部 位 脫 落，侵潤周圍的組織，啟 動 轉 移 程 序。本 研 究 中，經尖吻蝮蛇毒處理的 Ａ２７８０細胞形態發生了明顯變化：細胞變小、變圓、皺縮，且蛇毒質量濃度及時間與 Ａ２７８０細胞的形態變化呈劑 量依賴關系。Ａ２７８０細胞形態的變化可能是由于尖吻蝮蛇毒破壞了細胞結構，從而影響了維持細胞正常形態的 功能。當尖吻蝮蛇毒的質量濃度為２５μｇ·ｍＬ－１時，Ａ２７８０細胞活力低于５０％，顯示蛇毒對該細胞具有明顯 的抑制細胞增殖作用。蛇毒抑制癌細胞增殖主要通過兩個途徑：一是上調抑癌基因表達與下調促癌基因表達， 二是阻滯細胞周期。但尖吻蝮蛇毒抑制 Ａ２７８０細胞增殖的具體途徑還有待進一步的研究。在本研究中，當 尖吻蝮蛇毒質量濃度高于６．２５μｇ·ｍＬ－１時，Ａ２７８０細胞粘附率銳減，其中原因有可能是蛇毒引起受處理細胞 的緊密連接蛋白表達異常，從而導致細胞連接完整性被破壞，繼而使細胞之間粘附能力。然而，尖吻蝮蛇 毒影響 Ａ２７８０細胞粘附的分子機制也有待進一步探究。
